原生生物図鑑 | 関連情報 | 研究資料館 | 採集の記録 | 採集地ごとの生息情報 | 多様性ランキング |
Stentor pyriformis の 研 究

 概説2:S. pyriformis は独立栄養か? 
 概説1   概説2  生息場所 静止画・動画  論 文 
 培養法   学会発表  目からうろこ 実験データ

現在作成中(2017.02.14)。と同時に実験進行中。
とりあえず簡単に要点だけを記しておく。以後,少しずつ詳細を記す予定。

最初にS. pyriformisに遭遇した際に思ったこと, すなわち,冷涼で極度に貧栄養な環境にいながら,膨大な細胞数を維持していることから, もしかしたらS. pyriformisは,細胞内にいる共生藻が行う光合成だけで増殖しているのでは? という可能性についてだが,,。
既述したように,これまでは培養そのものがまったくできなかったので,この点について検討することができなかった。 しかし,S. pyriformisの培養を試みてから6年後(2016)にようやく実験室内で培養することに成功した。
その培養条件の要は,彼らの生息域と同様,極度の貧栄養状態(導電率は10 μS/cm以下)を保つことにあった。 ただし,これまでは餌生物として無菌培養したキロモナス(Chilomonas paramecium)を使用してきた。 なので,培養できたからといって,即,独立栄養だとはいえないのだが,そのあまりの分裂の遅さ(1ヵ月に1回)から 彼らは本当にキロモナスを栄養にしているのだろうか?という疑念が常にあった。
たしかにキロモナスが食胞内に入る様子は観察できているので,食べていることは確かなのだが, それならばもっと速く分裂できてもよいはずだ。だが,そうではないのだ。
もしかすると,もともとが従属栄養生物なので,いまだに細胞口があり,食胞形成能力はあるのだが, 捕食よりも共生藻による光合成に圧倒的に依存していることで大量増殖が可能になっているのではないか?
ということから,現在(2017〜)は,彼らが共生藻が行う光合成のみで増殖可能か否かを確かめる実験を行っている。

■ 独立栄養である可能性を示す状況証拠 ■
1)上記のように,野外では,山頂近くの湿原にある池塘など,雨水のみを水源とする極度の貧栄養環境(導電率は10 μS/cm以下)で大量に繁殖している。 それ以外の場所では,現在までのところ,まったく発見できていない。 極度の貧栄養環境のため,餌生物となり得る他の微生物はあまり多くない。なのに大量増殖している。
2)細胞内には常に大量の共生藻がいる。ミドリゾウリムシ(Paramecium bursaria)などは,共生藻によって餌生物がいなくても ある程度の期間は生き長らえることができる(光合成のみで増殖できるかは不明,これまでの経験上は無理だった,注)。 一方,餌のバクテリアなどが豊富にあると,ミドリゾウリムシの分裂速度が共生藻の分裂速度を上回るため, 次第に細胞内の共生藻の数が減る現象が観察できる(ただし,光がある環境では共生藻も増殖し続けるので,ゼロになることはない)。 また,ミドリゾウリムシは共生藻がなくてもバクテリアなどの餌生物があれば,他のゾウリムシ類と同様に,それだけで増殖することもできる。
しかし,S. pyriformisは,常に細胞内に大量の共生藻がいる。 これは,上記の分裂速度が極端に遅い(1回/月)ことの結果でもあるが, ミドリゾウリムシと異なり餌生物だけでは増殖できない可能性が高い。
→これについては近々,検証実験を行う予定。 これまでは培養法じたいが確立していなかったので確かめようがなかった。 現在は,培養法がほぼ確立したので,今後は,,,
 暗闇の中でキロモナスを与えても増殖するか?
を確かめる計画を準備している(明条件と暗条件での増殖速度の比較実験)。

注:後述するように,最近(2017),あらためて液肥と光のみで増殖できるかを試してみたところ, ミドリゾウリムシ(P. bursaria)も共生藻の光合成のみで増殖が可能であることが判明した。 餌生物(現在はキロモナス)がある時に比べると,分裂速度は落ちるものの,分裂を継続できることがわかった。 ミドリゾウリムシも,S. pyriformis同様(下記),条件的独立栄養生物といえるかも知れない。

■ 光合成だけで増えるかを確かめる実験を実施中 ■
・・・ もしかすると,うまくいったかも?
現在(2017.03.01),いくつかの条件で餌生物(キロモナス)を与えなくても増殖できるかを実験中。 蛍光灯ないしLED照明の下で培養を試みているが,すでに,1,2回は分裂したことを確認している。
しかし,carry over effect の可能性もあるので,あと1年は経過観察をしないとならない。 すなわち,これまでの分裂は,かつての培養条件にいた時の「たくわえ」で起きただけかも知れないからだ。 もしかすると,あと数回分裂した後は分裂できなくなって死滅してしまう恐れもある。 あるいは,ゆっくりと弱っていって1年後くらいになって死んでしまう可能性もある。
実際,過去には,ある培養条件では,最初の1年は順調に増えたが(といっても分裂回数はわずか10回程度だが), 1年後になってパタリと増殖が止って死に絶えてしまったことがあるので,油断はできない。

新たな発見:株(採集地ごとの違い)によって反応が異なる。
餌生物(キロモナス)と養命酒を使った培養法では,どこから採集したS. pyriformisでもほぼ同じ様に 増えているが(注:一部の株は,この培養法が確立する前に絶えてしまったので,確認できていないものもある), この餌生物を与えず,替りに液肥などを与える培養法だと,株によって反応が異なっていた。
同じ培養条件でも,徐々に弱って絶えてしまったものもあれば,逆に,同じ条件で元気に増殖しているものもいる。 ただし,これは,液肥に変えてから1,2ヵ月しかたっていない時の状態(2017.03頃)で,今後,時間が経過すると,いずれは これも弱って死んでしまう可能性は残されている。これもあと半年か1年以上経過しないと最終的な結論はだせない。
また,一部だが,同じ株でも使用したバッチによって反応が異なる場合もあるので,実験を始める前の細胞の状態の違いが 影響している可能性もある(いわゆる carry-over effect)。
いずれにしても,採集地の違いによって反応が異なるのは間違いなく,生息地によってかなりの違いがあるようだ。

注:ただし,現在の培養は無菌状態で行っている訳ではないので,液肥によって雑菌が増殖している可能性にも 注意しなければならない。培養液の交換はかなり頻繁に行っているで,餌生物(キロモナス)を使っている時と比べると, 目に見えるバクテリアの塊などはほとんどない。しかし,もともと増殖速度が極端に遅いので,ごくわずかの雑菌でも それが餌になって増殖する可能性は否定できない。
この実験は,理想的には無菌状態にして行う必要があるが,そのためにも,まずは液肥+光だけで増える条件をおおよそ 確立しておかなければならない。もともと増えるはずのない培養条件で無菌化しても無意味だからだ。 今後,現在有菌状態で行っているのを無菌化して再現可能かを確かめる予定だ。

問題:少数からスタートすると増殖しない。
単離培養にはいまだに成功していないのだが,キロモナス+養命酒の培養法だと10匹程度からだと大量に増殖させることができている。 しかし,この新しい培養法(光+液肥)だと10匹程度まで細胞密度を下げるとうまく増えてくれない (わずかに成功しつつある,2017.03.01現在)。 かつて,ゾウリムシを単離培養する際,塩溶液のみだとうまく増えてくれない場合は,exhaust medium などいわゆる conditioned medium を使っていた。 もしかすると,新しい培養法(光+液肥)でも何かを加えればうまく増えてくれるかも知れない。

追記(2017.08.20):現在の問題点

最大の問題は新しい培養法(光+液肥)だと, 極微細藻類( 小型のモノラフィディウム(Monoraphidium), コッコミクサ(Coccomyxa)類など ,これらは空気中から混入しやすい)が増えてしまい,その影響で,S. pyriformisが増えにくくなり,やがて死んでしまうことだ。 (これに気づくのにも時間がかかった,半年くらい?)
注:これまでのキロモナス+養命酒だと,従属栄養の細菌類はさかんに増えるものの,独立栄養の藻類はほとんど増えなかった。 しかし,光+液肥だと,細菌類はほとんど増えないが,替りに藻類が増えてしまうのだ。 (細菌も増えすぎるとS. pyriformisの増殖に悪影響があるが,多少いる程度ではほとんど問題なかった)

このため, 1ヵ月に1回程度しか分裂しないS. pyriformisと比べると,藻類は(細菌ほどではないものの)増殖が速いので, 4,5日放置しているとシャーレの底がこれらの藻で埋め尽くされてしまう。 こうなるとS. pyriformisは,すぐに死ぬわけではないが,増殖が止り,やがて=数週間後か1ヵ月後,死滅してしまう。
極めてやっかいなのは,いったんこの「死のスイッチ」が入ってしまうと,途中で微細藻を取り除いて丁寧に世話をしも, すで手遅れで,次第に弱って死んでしまうのだ!!。
なので微細藻がわずかな段階でも油断はできない。1細胞でも微細藻がいれば,数日後にはかなりの数に増えてしまい, 「死のスイッチ」が入ってしまう恐れがあるのである。 そうしないためには,可能な限り高頻度で(理想は毎日),培養液とシャーレを交換する必要がある。 とはいえ,様々な場所から採集したS. pyriformisを様々な培養条件で培養しているので, 現在,S. pyriformisが入ったシャーレは,100枚以上ある。 1つのシャーレをきれいに(=コンタミ藻を極力取り除き,培養液を新しい培養液に替えて,シャーレも新品に替える) するだけで5,6分(場合によっては10分以上)はかかるので, どんなに頑張っても一度にすべてのシャーレ交換を行うことはできない。 毎日シャーレの交換作業を続けても4,5日かかってしまう。 よって,全体の交換作業が終った頃には,すぐに次の交換作業を始めなければならないのだ。 これにより今年(2017年)は4月頃から,野外採集に出る日以外は,休日返上で毎日遅くまで培養の世話をしている(きつい〜!!)。
コンタミしている微細藻を除去するのにはピペットを使っている。 双眼実体顕微鏡下で,S. pyriformisのいない場所を探し,そこを狙ってピペットでコンタミ藻がいる培養液を吸い込んで捨てる (油断すると肝腎のS. pyriformisまで吸い込んでしまうので,この作業はかなり神経を使う)。 この作業を何度も繰り返すことで極力コンタミ藻を減らしているのだが,完全に除去するのは,難しい。 なので,結局,数日,あるいは,1週間後にはふたたびコンタミ藻が増え出すという 無限地獄 に陥っているのである。

この地獄から抜け出すには, 無菌培養 ができればよいのだが,そもそも細胞口を持つ繊毛虫は,無菌にするのが難しい(食胞内に未消化の細菌が残ってしまう; これに比べると細胞口を持たない鞭毛虫は,簡単に無菌化できる)。 とくにラッパムシの仲間は,食胞があるだけでなく,細胞後端部で基質に付着するために,そこでは粘着性の物質が絶えず分泌されている。 そこに雑菌だけでなく,微細藻も付着していることが多いので,これらを完全に取り除くのは困難を極める。 さらに言えば,上記のように,いまだに単離培養ができていない (できたとしても1つの細胞が2つになるまでに1ヵ月かかるので,ある程度の細胞数まで増えるには1年以上かかってしまう。 その間,何もせずただ待つだけならまだしも,毎日のように世話をしなければならないのだ。これを怠るとすぐに死んでしまうからだ。これは堪え難いストレスになる。) そして,なにより,現時点では,どのような培養液が無菌培養に適しているかも確定していないので,単離培養に挑戦することじたいに無理がある。 (実際は,何度か挑戦しているが,今迄のところ,ことごとく失敗している)。

■ もしかすると,他にも同じような生物がいるかも? ■
貧栄養の湿原には,他にもS. pyriformisのように,細胞内に多数の共生藻をもつ微生物がたくさんいる。 ただし,そのほとんどは,S. pyriformisほどには安定的に大量増殖してはいないが,,。

共生藻を持つ他のラッパムシ(Stentor fuliginosus):
S. pyriformisと同じく共生藻を持つラッパムシの仲間だが,やや小型。 S. pyriformisよりやや標高の低い場所で見つかることが多い(導電率の高い場所でも育つはず)。 安定して大量増殖していることは少ないが,ときおり大量増殖していることもある。 ただし,S. pyriformisと異なりキロモナスを与えるとかなりのスピードで増殖する。 その際,細胞内の共生藻の数は次第に減っていく模様。
したがって,餌を食べて増殖することは確かだが,S. pyriformisと同様の条件で,共生藻の光合成のみでも増殖しそうだ(現在,確認中)。

平地にいて共生藻を持つ他のラッパムシ, Stentor polymorphus も光合成のみで増えるかについても現在確認中。 ただし,S. polymorphusは,餌生物でよく増えるので,細胞内の共生藻は少なめの場合が多い。 餌生物を与えずに光+液肥だけにした場合どうなるか?を調べてみよう。
追記(2017.03.07):S. pyriformisと同じ条件で,わずかに増殖しているようにも見えるが, S. pyriformisほどは増えない(ようだ)。
S. polymorphusは,餌生物が十分にいる環境では,細胞内の共生藻は少なめだ。 キロモナスを使った培養では 1x KCM で培養しているので,液肥+1x KCM (+光)で培養を試みたが, 今(2017.03.07)のところ増える様子はない。

共生藻を持つクリマコストマム(Climacostomum):
これも細胞内に共生藻を持つ繊毛虫の仲間だが, これまでは無菌培養したEuglena agilis を餌に培養してきた。 その条件でも,細胞は内部にいる大量の共生藻によってパンパンに膨れた状態で増殖している。
もしかすると,このクリマコストマムも光合成だけで増殖するかも知れない。 これも現在確認中。 追記(2017.03.07): Euglena agilisを使った培養では 1x KCM で培養しているので,液肥+1x KCM (+光)で培養を試みているが, 今(2017.03.07)のところ増える様子はない。光を当てているのに,細胞内の共生藻は次第に減ってきている。 

ミドリゾウリムシ( Paramecium bursaria): 当初の予想では,液肥+1x KCM に移すと,しばらくは余力で分裂するとしても,次第に弱って分裂を止めるはずだったが, 実際にやってみると,餌生物(キロモナス)で培養した時にくらべると分裂速度はたしかに落ちたものの, ゆっくりとではあるが(それでもS. pyriformisよりは十分に速い) 分裂を続けている。これは予想外だった。これも上記のS. pyriformisの場合と同様, 液肥で増えた雑菌を食べて分裂している可能性もあるので,近々,無菌化した上で光りだけで増殖可能かを確かめる予定(2017.03.07)。

新しい課題:ミドリゾウリムシは,S. stentorと同様,光合成だけでも増殖可能なのに何故, S. stentorのように高地の湿原で大量増殖できないのか(注)?水温?
注:ミドリゾウリムシは,S. stentorと同じ湿原にもいるが,数は圧倒的に少ない。

体内に共生藻を持つ渦虫類
個体数はごくわずかだが,ときおり,体表直下に大量の共生藻をもつ渦虫(複数種)に遭遇する。 かつて何度か餌を与えて繁殖させようとしたが,ことごとく失敗した。 その頃は,S. pyriformisのように,貧栄養の条件が必須であることに気づかなかったので, 今後,遭遇した際は,貧栄養+光条件で繁殖するかを確かめてみたい。


月井 雄二
(法政大学 自然科学センター)

 概説1   概説2  生息場所 静止画・動画  論 文 
 培養法   学会発表  目からうろこ 実験データ