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pUC19を用いた遺伝子クローニング



1:pUC19DNAの単離

   これは通常のアルカリ法で行なう。

一日目 40ml L broth にアンピシリン(50ug/ml)を加え,これにpUC19をもった大腸菌株を接種。
    スターラーを用い37゚Cで撹拌培養を一昼夜続ける。 

二日目 新たに40ml L brothを加え,そこにスペクチノマイシンを300ug/mlとなるように
    加える。

三日目 遠心(3000rpm X 15')で細胞を集める。
    集めた細胞に 10 ml STEを加え細胞を懸濁させる。
    20 ml の Lytic solution (0.2N NaOH, 1% SDS) を加え,さらに数滴の
    ホルマリンを加える。
    スターラーにてゆっくりと撹拌する。(10分以上)
    撹拌しながら,15 ml 3M 酢酸ナトリウム (pH 4.8)を1〜2分かけて加える。
    白濁した後も5分前後は撹拌を続ける。
    その後,冷蔵庫に30分〜1時間放置。
    白濁液を遠心する(3000rpm X 10')。
    上澄みをとり,同量(45ml)のイソプロピルアルコールを加え,少し撹拌する。
    冷凍庫(-20゚C)に2〜3時間,あるいは一昼夜放置する。

四日目 遠心(3000rpm X 15')で沈澱を得る。
    沈澱を十分に乾燥させた後,pH7.0のトリス塩酸に溶かす。
     注意;酢酸ナトリウムの影響で酸性に傾きやすい。pH7.0に調整せよ。
    これにRNase A を加え,37゚C水浴中で30分以上反応させる。
    SDS/PHENOL処理を行なう。ホルマリンで処理した後,イソプロパノール沈澱。
    冷凍庫(-20゚C)に2〜3時間,あるいは一昼夜放置する。

五日目 遠心(3000rpm X 10〜15')で沈澱を得る。
    十分に乾燥させた後,滅菌水(〜1ml)に溶かす。



2:pUC19DNAの制限酵素による切断とその断片の精製

切 断
  エッペンドルフチューブの中でDNAを9,10x酵素反応緩衝液を1の割合で混ぜる。
  制限酵素を反応液の1/100〜1/20 程度加える。
  37゚Cで2〜3時間,あるいは,一昼夜反応させる。
  切断がどの程度おきたかを,電気泳動で確認する。

精 製
 electroelution:
  反応液をアガロースゲル電気泳動する。
  (注意,他の核酸が混入しないように緩衝液は新しいものに取り替えてから泳動を行なう)。
  泳動後,ゲルをアズールCにて染色する。
  バンドが確認できるようになったら,切断された部分をカッターで切り出す。
  切り出したゲルを少々希釈した泳動用緩衝液の入った透析チューブに入れる。
  これを再び泳動槽に入れて通電する(50〜100V X 30'程度)。
  通電の最後には,電極を反対にして3分ほど通電し透析チューブにくっついたDNAをはがす。
  縛ったチューブの先端をはさみで切断し,内部の液を試験管に移す。

 濃縮:
  ブチルアルコールを加え,キャップをした上で激しく撹拌する。
  1分弱3000rpmで遠心し,アルコールと水相を分離する。
  アルコールを捨て再びブチルアルコールを加える。

注意;
 この際,アルコールは水相の1〜2倍にとどめる。あまり多過ぎるとすべての水分がアルコール相に吸収されてしまう。あやまってそうなった場合は,少量の水を追加すれば再び水相が分離してくる。
  適当なところまで濃縮されたなら,ホルマリンを加え撹拌,遠心。
  今度は水相が上部にくるのでそれをとってイソプロピルアルコールで沈澱させる。
この際,核酸の量が少なく沈澱し難いことが予想される場合は,キャリアーとしてのRNAを加えてから沈澱させる。ただしキャリアーを加える場合,それが以後のプロセスで問題にならないことを十分に確認すること。いわゆる「精製」をするなら加えてはいけない。(Ligationなどの実験に用いるなら加えても問題はない。)



3:クローニング対象となるDNAの準備

 pUC19は自分自身が小さいのでその分大きなサイズのDNAをクローニングできる。
 クローニング対象となるDNAを準備する際には,以下の点に注意。
  対象以外のDNAがコンタミしないように気をつける。
   例:あるサイズのDNAをクローニングしたい場合は,ゲル電気泳動などで
     サンプルに混入している他のサイズのDNAを除去する。

 注意:M13などのファージの場合は,ファージ粒子に納まるサイズでないとクローニングできない。M13ではあまり大きなサイズのDNAはクローニングできない。
 失敗例:これに気付かずに必死になって2〜9Kbの断片を組み込もうとしたがまったく組換体は得られなかった。



4:Ligation

 2,3)で準備された2種のDNAを混ぜ,T4DNA リガーゼにより結合させるわけだが,この
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5:形質転換

 これについては,「形質転換」を読むこと。

 サンプルの保存:
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6:組換え体の確認 ミニスクリーニング

 シャーレのコロニーから
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