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CaCl2 法による大腸菌の形質転換


バクテリアの準備

　形質転換に用いる大腸菌は，なんでもよいというわけではない。後で述べるように，形質転換の際に用いるプラスミドにＥｃｏＲＩで切断される部位がある場合は，通常の大腸菌に入れても制限酵素ＥｃｏＲＩが作用するので，形質転換の効率が非常に低くなる。効率を上げるためには，制限酵素遺伝子が機能を失ったrestriction negative(hsdR)株を用いる。（例えば，C600 rm, MC1061 :C600 rm　は，modification negative (hsdM)でもある。）

ただし，いったんrestriction & modification positive,の株で増殖したプラスミドは，Eco RI site が修飾されるので，つぎの形質転換の際に宿主細胞が hsdR であるか否かを気にする必要はない（しかし，そのプラスミドは，Eco RIで切ることができないので利用価値は低くなる）。逆に，C600 rm などで増殖したプラスミドは，Eco RI site が修飾されていないので restriction & modification positiveの株に入れるのは困難である。

　　C600 rm　　hsdR, hsdM, supE, lac, leu, thr (r- m-)
　　MC 1061　　hsdR, supo, araD139, lacX74, Δ(ara,leu), galU, galK, strA


バクテリアの培養

　バクテリアは，Tryptone-yeast extract medium (L broth) で培養する。

L broth の組成

glucoseは入れないこともある

　本来は，37ﾟCで，振とう培養するのだが，振とう器がなかったのでつぎの方法を採用した。
　まず，試験管に入ったL broth 3 mlにバクテリアを接種し，一晩培養する。

　注意：　また，以前は，増やし過ぎたバクテリアを後で使うために冷蔵庫に保存していたが，これは危険だ。後で使用する抗生物質で死なないコンタミがおきていた場合は，それらを形質転換体と見誤ってしまう。････これでだいぶ失敗した。各実験ごとに改めて培養をスタートしたほうが無難だ。


形質転換

形質転換法

　

　翌日，一部を新しい培養液に移植し１〜２時間培養する。これで増殖期の細胞をつくる。バクテリアを 2000 rpm x10'で遠心し集菌する。これに，あらかじめ0ﾟCに冷してあった CaCl2 50 mM（滅菌ずみのもの，緩衝液は含まない）をもとの培養の1/2 程度加え，0ﾟC で，20〜30' 置く。これで， conpetent cell ができる。

　＊細胞を冷やすには製氷機の氷を利用できればよいが，ないので近くのデイリーストアーから買ってきたロックアイスを砕いて利用する。意外と便利。それほど金もかからない（１kg＝200円）。

　つぎに，また集菌して (2000 rpm x10')，もとの培養の 1/50 〜1/100 程度に濃縮した状態で， CaCl2 50 mM に suspendする。この液 50〜100 ulに対し 0.1〜0.5 ug の pBR322 DNA を加え，0ﾟC で（on ice ; <4ﾟC ）20〜30'静置する。

　その後，1 mlの L brothを加え，37ﾟCで30〜60'おいてから，適当な選択マ−カ−を含んだ軟寒天培地（Tryptone-agar ）に撒くか，あるいはファージＤＮＡの場合は，軟寒天培地に宿主細胞とともに撒く。

Tryptone-agar の組成

　注意；実際には，いちいちTryptone-agar をつくっているのは面倒なので，通常のバクテリア培養液（Tryptone, NaCl, YeastExtract）＋寒天で代用している。

　

形質転換の検出＆選択培地の作成法

　

アルカリ法

　追記：軟寒天培地は，以下のようにして作る。（途中）

　以上の方法は，東大応微研　第２研究部　高橋秀夫氏から教えてもらったものを中心にまとめたもの。

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