Ampr Tetr ---> Ampr Tets でスクリ−ニングする。
transformation --> LB 30' --> Amp (50 ug/ml) 37゚C x 3 hr
↓
+ 20 ug/ml Tet 37゚C 45' incubate
↓
+ 150 ug/ml シクロセリン 37゚C 3 hr incubate
↓
DW に suspend 5 ml
↓
50 ug/ml LB 1.3 ml 37゚C 30'
↓
+ 2.7 ml LB 0.7 % Agar
up 0.7 % Agar up 50 ug/ml Amp
down 1.5 % Agar down 50 ug/ml Amp
寒天を重層する。
Bochner et. al. (1980) Positive selection for loss of tetracycline resistance. J. Bacteriol. 143:926-933.
クロラムフェニコ−ルによるプラスミドの増幅
この方法は,R1プラスミドに適用されるものでどんなものでもOKという訳ではないらしい。
1日目 25ug/mlのテトラサイクリンを LB(5ml)に入れ一晩培養。
2日目 600mlのLBに移し,3時間後に,250ug/ml(最終濃度)のク ロラムフェニコ−ルを加える。一晩培養。
3日目 集菌し,4゜C,100mlのTrisEDTA(pH8.0)で洗う。
再び集菌し,2mlのSET(0゜C)中で,リゾチ−ム処理(10分間)
その後,0.25M EDTAを加え(4゜C,1ml)
つぎに,1% Brij,0.4% DOC,0.06M EDTA
TrisHCl (pH8.0) を3・2ml加える。(10分処理)
48000gで,4分間遠心。
CsClで分離。
Uhin (1979) Gene 6; 91-106.