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組換えプラスミドを選択する方法

Bochner, et. al. の方法                          

Ampr Tetr ---> Ampr Tets でスクリ−ニングする。

transformation --> LB 30' --> Amp (50 ug/ml) 37゚C x 3 hr

   ↓

+ 20 ug/ml Tet 37゚C 45' incubate

    ↓

+ 150 ug/ml シクロセリン 37゚C 3 hr incubate

    ↓

DW に suspend 5 ml

    ↓

  50 ug/ml LB 1.3 ml 37゚C 30'

    ↓

      + 2.7 ml LB 0.7 % Agar

  up 0.7 % Agar     up 50 ug/ml Amp

  down 1.5 % Agar     down 50 ug/ml Amp

   寒天を重層する。

  Bochner et. al. (1980) Positive selection for loss of tetracycline resistance. J. Bacteriol. 143:926-933.

クロラムフェニコ−ルによるプラスミドの増幅

 この方法は,R1プラスミドに適用されるものでどんなものでもOKという訳ではないらしい。

1日目 25ug/mlのテトラサイクリンを LB(5ml)に入れ一晩培養。

2日目 600mlのLBに移し,3時間後に,250ug/ml(最終濃度)のク    ロラムフェニコ−ルを加える。一晩培養。

3日目 集菌し,4゜C,100mlのTrisEDTA(pH8.0)で洗う。

    再び集菌し,2mlのSET(0゜C)中で,リゾチ−ム処理(10分間)

    その後,0.25M EDTAを加え(4゜C,1ml)

    つぎに,1% Brij,0.4% DOC,0.06M EDTA

     TrisHCl (pH8.0) を3・2ml加える。(10分処理)

    48000gで,4分間遠心。

    CsClで分離。 

 Uhin (1979) Gene 6; 91-106.

     

 


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