1)1日目,適当な抗生物質を含んだ培養液, 5 mlにバクテリアを移植し,37゚Cで振とうしながら一晩培養する。
2)2日目,その1.5ml をエッペンドルフチューブに入れ1分間遠心。残りは4゚Cに保存する。
3)遠心の後,上澄みを除去する。
4)沈澱に対し以下の溶液を0.35ml加える。
8% sucrose
0.5% Triton X-100
50mM EDTA(pH 8.0)
10mM Tris-Cl(pH 8.0)
5)25 ul のリゾチーム(10mg/ml in TrisCl, pH 8.0)を加え,3秒間 振とう。
6)チューブを沸騰水に40秒間浸す。
7)ただちに,室温で10分間遠心する。
8)遠心沈澱を爪楊枝で除去する。
9)残った上澄み(375 ul)に 40 ulの 2.5 M Sodium acetate ,および 420 ul のイソプロパノールを加える(375+40+420=835)。
激しく振とうした後,ice/ethanol bathに15分間静置。
<これで核酸が沈澱する>
10)4゚C で15分間遠心する。
11)沈澱物をいったん乾燥させ,DNase-free RNase (50ug/ml)を含んだTE(pH 8.0)50 ul に溶かす。
この処理で,小分子のDNA が RNAによって隠されないようになる。
12)この後, 50 ulの一部に適当な緩衝液,および制限酵素を加え反応を起こさせる。
残りをすぐに使わない場合は,-20゚C に保存する。
BOILING METHOD
Holmes & Quigley (1981)