アメ−バＦ株に由来するＲＮＡプラスミドの単離

細胞質の分画を行なった後で，核酸の単離をする場合

moeba proteus 株の中で，Ｆ株だけは細胞の中（おそらく細胞質）に　kbの大きさのdsRNA を持つことがわかった。以下にその単離法について説明する。

アメ−バの培養

　　　　ＫＣＭのイオン組成：　　　　 K Cl

Ca Cl2　　　　 別紙参照

　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Mg Cl2 　　　　　　　　　　　　　　　　

　　　＊ＫＣＭを作るには，100 倍の原液を作っておき，使用時に希釈する。

テトラヒメナは，通常の Polypeptone,Yeast extract,glucose(PPYG)培養液により培養した。

PPYG の組成：　　　　　　Polypeptone 　　　 2 %

　　　　　　　　　　　　　　Yeast extract 　　 0.2~ %

　　　　　　　　　　　　　　glucose 　　　　 0.1~0.2 %

注意：上記の PPYG medium に移植してから２〜３日たったものを餌として用いる。これ以上経過したものは，餌として加えた際に死体がでる。死体がでると，培養液が汚れる結果，餌を食べている最中のアメ−バは本来シャ−レに硬く接着しているはずのものが，死体からでた成分の影響でか，非常にシャ−レからはがれ易くなり，その後の旧くなった培養液の交換がやりずらくなる。そのため，死体がでやすくなったもの，すなわち， PPYG medium に移植してから２〜３日以上たったものは，餌としては使用しないほうが賢明である。

　昭和６１年末から菅井氏の開発した新しいPPYG培養液を採用した。

　この培養液では，ポリペプトンとグルコースの量比が逆転している。

アメ−バ細胞の集め方 　これは至極簡単。アメーバは泳がないので，シャーレのそこに沈むのを待って，上澄みを捨て，できるだけ細胞密度を高くした後，スピッツ管に入れててまわし遠心機で遠心する。ゆっくり回すだけですぐに試験管の底に細胞のペレットができる。

ｄｓＲＮＡの単離

　　ＳＴＥとは・・・　　　　　　　　原液　　 200mlあたり　　

　　0.1 M NaCl　　　　　　5M NaCl 4. ml /200ml

　　　　0.05 M Tris pH 7.0　　1M Tris 10. ml /200ml

　　 　0.001 M Na2-EDTA　　　　0.5M EDTA　 0.4 ml /200ml

Ｂ：つぎに，おなじＳＴＥ（含：15％ EtOH ）に浸したセルロ−ス（例；2.5 gr dryweight）をカラムにつめ（カラムはパスツ−ルピペットで代用可），これに上記の資料を流す。流すといっても，つまって流れにくいので，ピペットの上にキャップをつけて無理矢理圧力をかけてやると早く落ちる。
　（この方法も，その後改良された。カラムについては特別注文で少し大きめのものを作ってもらった。また，キャップをつけて手で押したのでは疲れるので，二連球と呼ばれるゴムでできた簡易加圧器具を使うと簡単になる。二連球の先についているゴムの管をカラムに接続するのである。そうしてからゴムの部分に空気を送り込み加圧状態にする。そうすれば自然にカラムの方にも圧力がかかることとなる。）

　これで，ｄｓＲＮＡのみがセルロ−スに吸着される。余分なものを８倍容量のＳＴＥ（含：15％ EtOH ）で洗い流す。

Ｃ：つぎに，エタノ−ルを含まないＳＴＥを流すと，吸着されていたｄｓＲＮＡが出てくる。
　　＊この方法は根気がいるが，得られるｄｓＲＮＡの量，純度は非常に高い。

　この他に簡便法として，セルロ−ス粉末を加えたあと振とうし，遠心で粉末を集め，ＳＴＥ（含：15％ EtOH ）で洗った後，エタノ−ルを含まないＳＴＥで振とうして，ｄｓＲＮＡを取り出そうとした。しかし，この方法では，あまりきれいに単離できなかった。一度位の遠心では十分にｄｓＲＮＡと他が分けられないのかも知れない。

参考文献：

　　？？？？