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核酸関連諸酵素の処理・保存条件

       Stock solution    Working solution      

RNase A:   10 mg/ml in Tris-Cl pH 7.5    dilute 1/10-1/100 by SSC

        15 mM NaCl            at 37゚C

        100゚Cにて15' 煮沸 

        store at -20゚C

RNase T1:

DNase I:

Pronase: 20 mg/ml in DW          dilute 1/20 (1 mg/ml) by

     37゚C で self-digestion        0.01 M Tris-Cl pH 7.8

  store at -20゚C        0.01 M EDTA

                     0.5 % SDS  at 37゚C

Proteinase K: 20 mg/ml in DW          dilute 1/400 (50 ug/ml) by

        store at -20゚C          0.01 M Tris-Cl pH 7.8

                        0.01 M EDTA

                        0.5 % SDS   at 37゚C

20 x SSC:   NaCl    175.3 g      ( 3 M )

       Na-citrate    88.2 g      ( 0.3 M )

       H2O      800 ml

            pH 7.0 (with 10 N NaOH)

                       per liter?

       *sterilized by autoclaving

Alkaline phosphatase

                       0.1 unit/ug DNA at 65゚C

                        25 mM TrisHCl pH 8.0

                        for 30 min

特 別 な 酵 素 類                            

S1ヌクレアーゼ (Aspergillus oryzae)                    

 この酵素は,single stranded DNA を切断・分解する。dsDNA, dsRNA, DNA・RNA hybrids は比較的分解されにくい。しかし,大量の酵素があると二重ラセンも分解する。

 single-standed RNA も多少は分解するが,DNA のほうにより活性がある。

ssDNA or ssRNA -- pH 4.5, Zn++ -- 5'pdN or 5'prN

Terminal transferase (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) calf thymus  

 この酵素は,deoxynucleotidesをDNA 分子の3'-OH 末端に付ける働きを持つ。

Micrococcal Nuclease                            

 mRNAの分解に用いられる。Caイオンの存在下で活性を持つ。

 STOCK SOLUTION:

 50 mM  CaCl2

     100 mM EGTA (pH 7.0)

    micrococcal nuclease (150,000 units/ml)

       in 50 mM glycine(pH 9.2) & 5 mM CaCl2

     creatine phosphokinase type I (40 units/ml) in 50% glycerol

    hemin stock; 4 mg/ml in ethylene glycol

      hemin stock solution 1) 20 mg of hemin in 400 ul of 0.2M KOH

2) H2O 600 ul

                  1 M TrisCl (pH 7.8)  100 ul

                  (0.1 M HCl で pH 7.8 にする)

                 3) 4 ml ethylene glycol

                 5000g で遠心,不溶物を除去

                  1,2,3 の順に加える。

     これはreticulocyte lysate initiation factor E1f2aの阻害剤

 手順: 100  reticulocyte lysate

      1 hemin solution

      2 CaCl2 solution

       mix

      0.05 micrococcal nuclease (150,000 units/ml) for 15' at 20゚C

       2 100 mM EGTA

      0.4  creatine phosphokinase (40 units/ml)

              dispense the treated lysate in 250-500 ul

              store at -70゚C


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