３ 培養法

２）単離した細胞を培養する

b. 二員培養

b-1. 完全な除菌を行なわない「二員培養」 　既述したように，これは厳密な意味では二員培養とはいえないが，とりあえずここで紹介しておく。この方法は，他の原生生物（繊毛虫や藻類など）を餌にする アメーバや ユープロテス， フロントニア など用の培養法である。この場合も２通りの培養法がある。すなわち，（1）餌生物の養分を同時に加えて，餌生物を増やしつつ目的の原生生物を増やす方法と，（2）あらかじめ餌生物を塩溶液で洗い，もとの培地を取り除いた上で与える方法，である。 　いずれの場合も，ここでは常に雑菌が混在しているため，それらが増え過ぎて培養に悪影響がでないように注意する必要がある。そのため，（1）の場合は，餌生物の養分となるのは，液体培地ではなく，固形の養分（米粒やキナコなど）に限られる。液体培地だと前述のゾウリムシの説明にあったように，雑菌が増え過ぎる恐れがあるためである。（2）の場合に，餌生物を洗ってから与えるのも同じ意味がある。すなわち，餌生物用の培養液まで一緒に与えると，それによって雑菌が大量に増えて培養に悪影響が出るからである。したがってまた，いずれの場合も，定期的に汚れた培養液（正確には養分を含まないいわゆる塩溶液）を新しいものと交換する作業が必要になる。それらの条件が満たされることで，雑菌が混入しても培養に悪影響を及ぼさない程度に常に雑菌の増殖が抑えられるため，完全な除菌を必要としないのである。

米粒（または麦粒） 　もっとも手軽な方法といえる。シャーレなどに適当な塩溶液を入れ，これに米粒（あるいは麦粒）を数個入れる。そして，この中に原生生物を入れて飼育する。バクテリアが餌の場合は米粒を入れるだけだが，場合によっては下記のように餌となる適当な他の微生物を混ぜることもある。ただし，この方法は，既述したように，空気中から雑菌やカビ，ときにはワムシなどの多細胞生物が混入しやすいため，培養条件は一定しない。安定して長期間手入れなしで飼育できるようになることもあるが，あまり富栄養条件にすると混入した雑菌などが増えすぎるのでよくない。そのため，大量培養には向かない。 　様々な種に適用できるが，当方では，これまで アメーバ・プロテウス （米粒とキロモナスで培養）や スピロストマム （米粒にミズカビがついた条件が最適），あるいは ユープロテス （米粒＋テトラヒメナ等）などの飼育に用いた経験がある。しかし，上記のように常にうまくいくとはかぎらない。しかし，中にはスピロストマムのようにこれ以外に適当な培養法がみあたらないものもいる。

キナコ 　キナコ 1 g を 1 リットルの脱イオン水（または後述するドリル氏液）に入れて，かき混ぜた後，その上澄みをガーゼで漉し取る。大きな顆粒はガーゼに残るが，細かなものはガーゼを通過して濾過液に混じってくる。この方法は，それらの固形物から少しずつ溶け出す養分でバクテリア（もしくはその他の餌用微生物）が増え，それを食べて原生生物が長期間維持できることを狙っている。濾過液をフラスコに適量入れ，滅菌せずに原生生物の培養用として使用する。 　これは後述する滅菌してから行うキナコ上澄培養とは異なるので注意してほしい。後述する滅菌キナコ上澄培養では，加圧滅菌処理の過程でダイズの固形成分から養分が抽出されるため，培養液はかなりの富栄養状態になる。このため接種したバクテリアがいっきに増え，それを餌とする原生生物細胞も急速に増える。しかし，餌がなくなると急速に飢餓状態になるので，長期間手を加えずに培養を維持することはできない。一方，未滅菌の場合は，固形成分から栄養分が徐々に溶出してくるので，バクテリア，原生生物ともに急速に増えないかわりに，長期間手を加えずに培養を維持することができる。（ただし，雑菌の混入，空中からの胞子による鞭毛虫などの混入は避けられない。雑菌が混入しても富栄養ではないので極端に培養が汚れることはないが・・・）

b-2. 完全に除菌してから行なう本物の二員培養 　この場合，完全に餌生物以外の雑菌等の混入がないことを前提とするので，培養液は液体培地を用いることができる。すなわち，餌生物を栄養豊富な液体培地で増殖させながら，これをそのまま餌として与えるのである。ゾウリムシを実験用に培養するには通常この方式が用いられる。 　ただし，この方式は，実際には，培養を継続している間に雑菌が混入する可能性が高く，仮に混入した場合，培養液には餌用のバクテリアがいて始めから濁っているので，雑菌が混入したことがわかりにくい。そのため，知らない間に多くの雑菌が混入して培養に悪影響が出る恐れがある（これに対して，後述する無菌培養の場合は，培地が透明なため，細菌やカビが混入すると培地が濁ってくるので，一目瞭然である）。 　以下に主な液体培地の作り方を紹介する（多くはゾウリムシ用だが，これらは他のバクテリアを餌とする繊毛虫にも適用可能なはずである）。

レタスジュース 　ゾウリムシ（ Paramecium caudatum ）の培養用に長年利用されている培養法で，これで餌バクテリアを増殖させ，そのままゾウリムシに与える。 　作り方：新鮮な葉レタスを熱湯で軽く湯がき，細胞内にある分解酵素を失活させる。それを冷やした後，ミキサーで破砕してから，ガーゼでくるんで絞る。その絞り汁を３日間，間欠滅菌（100℃，１気圧での蒸気滅菌）し，それをレタスジュースの原液として冷暗所に保存する。オートクレーブ（2.2気圧，120℃で20分間の滅菌）をせず，間欠滅菌をするのは，レタスジュースに含まれる固形成分（葉緑体など）がオートクレーブをすると凝集して沈澱してしまうためである。 　培養液を作る際は，この原液を使用する前日に滅菌したドリル氏液（後述，塩化カルシウムは別に滅菌）に加え，さらに，滅菌した塩化カルシウム液と餌用のバクテリア（Klebsiella pneumoniae）を加えて，１日後に使用する。

アカエンドウマメ浸出液 　筆者が考案したレタスジュース培養の変法。アカエンドウマメは，値段が安く，乾物なので一度に大量購入して長期間保管できる。作成した原液，および餌バクテリアを移植する前の培養液も室温で長期保存できるのが特徴。この培養液は透明だが，バクテリアが増えると濁ってくる。 　作り方：（詳しくは ６補遺-1 で紹介する）マメ20ｇを800mlの水にいれ，エタノールに溶かした5mg/mlのスティグマステロールを4ml加える。これをオートクレーブ（加圧滅菌；120℃, 20分）し原液として室温保存。使用の際は，上澄みを８枚位重ねたガーゼを通して瀘過，水を加えてもとの800mlに調整する。その100mlに水，ドリル氏原液を加え滅菌する（使用時まで室温保存）。滅菌前は懸濁しているが，ドリル氏液とともに滅菌すると茶褐色の透明な液体になる。使用前日に餌バクテリアと塩化カルシウムを加え，一晩培養する。

キナコ上澄 　レタスジュースの替わりにキナコの懸濁液を用いる。材料がコンビニなどで簡単に入手できるのが利点。キナコは脂質が多いためこれでゾウリムシを培養すると，細胞内に顆粒が増え，細胞質が不透明になる。透過光では，細胞は黒ずんで見える。このことを応用してホモ・ヘテロ接合対の識別が可能（月井，遺伝，1993）。分裂速度，細胞密度，接合型活性はレタス，アカエンドウなどと同様。 　作り方：キナコ1gを1000mlの水にけん濁させる。しばらく静置した後，沈澱ができるだけ混じらないようにして上澄みをガーゼに通し，これにドリル氏液（後述）を加え滅菌する。使用前に餌バクテリア（Klebsiella pneumoniae）を接種し，一晩以上培養する。

セロフィル 　ヒメゾウリムシ（Paramecium aurelia complex）で長年用いられてきた培養液。しかし，日本ではセロフィルは手に入りにくい（輸入品）。 　作り方：煮出し汁を作り（？g/1000ml），使用する前日に餌バクテリア（Klebsiella pneumoniae）を接種する。

ワラの煮汁 　基本的にはセロフィルと同じ。すなわち，煮出し汁に餌バクテリアを接種して培養液とする。これはワラが入手しずらくなったこともあって，現在は実験用にはあまり使われない。 　煮出し汁の替わりにワラをそのまま利用する方法もある。固形物であるワラをそのまま入れておくと長期間手入れせずに保存がきくため，系統保存用として利用しているところもある。

カロリーメイト 　カロリーメイトは近年ゾウリムシの培養用として利用されるようになった。基本的。 　作り方：？？？